Akademik Veri Yönetim Sistemi
Sipahioğlu H. M.(Yürütücü), Özcan Yardım D.
Yükseköğretim Kurumları Destekli Proje, 2013 - 2015
Sıcaklığa dayanıklı amilazlar nişasta endüstrisi başta olmak üzere; gıda, yem, kağıt, tekstil, deri ve deterjan üretimi gibi alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte termostabil amilaz enzimlerinin üretimi, birçok hipertermofilik mikroorganizmada endüstriyel kullanım için düşük miktardadır. Yürütülen bu çalışmada termostabil α ve β amilaz enzimlerinden sorumlu genler spesifik gen kaynaklarından izole edilerek iki farklı klonlama bölgesine sahip pET-Duet-1 ekspresyon vektörüne aktarılmış ve elektroporasyon yöntemi ile Escherichia coli BL21 kompetan hücrelerine transforme edilmiştir. Gen kaynağı olarak, α amilaz geni için Bacillus stearothermophilus DSM 22 ve β amilaz geni için ise Thermoanaerobacterium (Clostridium) thermosulfurogenes DSM 2229 suşlarının genomik DNA'ları kullanılmıştır. Rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterileri nişasta içeren ampisilinli katı LB ortamlarda geliştirilerek iyot buharı ile boyanması sonucunda rekombinant bakterilerde amilaz enzimlerinin aktif olduğu tespit edilmiştir. Her iki enzimin daha çok üretilmeleri IPTG indüksiyonu ile gerçekleştirilmiş ekspresyonu arttırılan rekombinant BL21/αAmy ve BL21/βAmy bakterilerinden, Ni-NTA kullanılarak α ve β amilaz proteinleri saflaştırılmıştır. Saflaştırılan histidin ile işaretli proteinler SDS-PAGE ve western blot yöntemleri ile tespit edilmiştir. Saflaştırılan rekombinant proteinlerden α amilazın yoğunluğu 4,59 µg/ml ve β amilazın yoğunluğu ise 3,17 µg/ml olarak hesaplanmıştır. Her iki enzimi eşzamanlı aynı bakteride ekspresyonu amacı ile rekombinant BL21/αAmy bakterilerinden kompetan hücreler hazırlanmış ve bu hücrelere rekombinant pETDuet/β plazmidi aktarılmıştır. Her iki rekombinant plazmidin aynı bakteride bulunduğunu doğrulamak için elde edilen kolonilere koloni-PCR testi gerçekleştirilmiş ve kolonilerden bazılarının hem α hem de β amilaz genine sahip olduğu tespit edilmiştir. Eş zamanlı eksprese edilen enzimlerden α amilazın 60 kDa, β amilazın ise 55kDa büyüklüğünde olduğu teyit edilmiştir.