Ankaferd BloodStopper’in in vitro Ortamda Primer Duysal Nöronlara Dejeneratif Etkisi


Creative Commons License

Üstün R.

14. ULUSAL SİNİRBİLİM KONGRESİ, Ankara, Türkiye, 26 - 29 Mayıs 2016, cilt.10, no.1, ss.34

  • Cilt numarası: 10
  • Basıldığı Şehir: Ankara
  • Basıldığı Ülke: Türkiye
  • Sayfa Sayısı: ss.34

Özet

Ankaferd BloodStopper’in in vitro Ortamda Primer Duysal Nöronlara Dejeneratif Etkisi

Ramazan Üstün1, Elif Kaval Oğuz2

1Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Tıp Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı

2Yüzüncü Yıl Üniversitesi, Eğitim Fakültesi Fen Bilgisi Eğitimi Anabilim Dalı

 

AMAÇ

Ankaferd BloodStopper (ABS) hemostatik ajan olarak kullanılan, sağlık bakanlığınca ruhsatlandırılmış bitkisel bir ekstraktır. Ürünün cerrahi ve dental girişim kullanımında sinir fonksiyon sorunları bildirilmiştir. Klinikte karşılaşılan bu sorunu aydınlatmak amacıyla “Fare Dorsal Kök Gangliyonu Nöron Kültürü Modeli'nde” ABS’nin periferik sinir hücrelerine dejeneratif etkisi ve mekanizması araştırıldı.

 

YÖNTEM

Nöron Kültürünün Hazırlanması: Fareler ksilazin+ ketamin anestezi ile uyutulduktan sonra servikal diseksiyon ile sakrifiye edildi. Dorsal kök gangliyonlar aseptik şartlarda mikroskop altında çıkartıldı. Hücre ayrışması kolagenaz+tripsin+mekanik tirtürasyon ile, saflaştırılması percoll yoğunluk gradiyenti ile yapıldı. Elde edilen hücreler cam tabanlı 35 mm lik petrilere ekildi. Nöron kültürü 37 °C’de % 5 CO2 sirkülizasyonu olan nemli ortamda 48 saat inkübe edildi. Ölü nöronları görüntülemek için propidium iodure(10μg/ml), canlı nöronları görüntülemek için Calcein AM(1μM) eklendi.

 

Mikroskobik Görüntüleme: Nöronları fizyolojik şartlarda tutabilen gelişmiş dijital kamera - bilgisayar ve özel yazılım düzeneği ile istenilen sıklıkta ve modda görüntülemeye imkan veren “Zeiss Cell Observer” mikroskobik görüntüleme sistemi kullanıldı. Canlı-ölü nöronları görüntülemek için Mozaix modu seçildi. 0.ve12.saatlerde aydınlık saha ve floresan görüntüleri kaydedildi. Nöronlardaki anlık değişimleri saptamak için Time lapse modunda 5 dakika aralıkla 12 saat nöronların görüntüleri fotoğraflandı.

 

Gruplar: Çalışma üç deney, bir kontrol olmak üzere 4 gruptan oluşturuldu. Grup I: ABS grubu, Grup II: Caspase-3 inhibitörü+ABS grubu, Grup III: Caspase-6 inhibitörü+ABS grubu, Grup IV: Serum fizyolojik (SF) grubu. İnkübatörde 48 saat kalan nöron kültürüne Grup I’de %2.5 ABS, Grup II’de 100μM Caspase-3 inhibitörü bir saat sonra %2.5 ABS, Grup III’de 100μM Caspase-6 inhibitörü bir saat sonra %2.5 ABS, Grup IV’de %2.5 SF eklendi.

 

BULGULAR

Çalışmanın başlangıcında Grup I de 243, Grup II de 231, Grup III te 175, Grup IV te 249 canlı nöron görüldü. 12 saat sonra floresan mikroskopla yapılan incelemede ABS uygulan gruplarda (I. II. III.), uygulama öncesi canlı olduğu saptanan nöronların tamamının öldüğü, SF uygulanan kontrol grubunda ise 5 hücrenin öldüğü, 249 hücrenin canlı kaldığı görüldü.

 

Canlı kalan nöron oranları bakımından gruplar arasında fark olup olmadığını belirlemek amacıyla “Z testi”yle oran karşılaştırılması yapıldı. Deney grupları arasında canlı hücre oranları bakımından istatistik olarak anlamlı fark bulunmazken, her üç grubun kontrol grubundan olan farkı, istatistik olarak anlamlı bulundu (P < 0,01).

 

SONUÇ

1. Ankaferd BloodStopper duysal nöronları dejenerasyona uğratmaktadır.

2. Nörodejenerasyon yolağında Caspase-3 ve Caspase-6 enzimleri yer almamaktadır.

3. Ankaferd BloodStopper’in kullanımında nörodejeneratif etkisi dikkate alınmalıdır.

 

Anahtar Kelimeler: Dorsal kök gangliyon nöronu, Ankaferd BloodStopper, dejenerasyon

The in vitro degenerative effect of Ankaferd BloodStopper on primary sensory neurons

 

Ramazan Üstün1, Elif Kaval Oğuz2

1Yuzuncu Yıl University, Faculty of Medicine, Department of Physiology

2Yuzuncu Yıl University, Faculty of Education, Division of Science Teaching

 

AİM

Ankaferd BloodStopper (ABS) is an herbal extract which is licensed by the Ministry of Health and used as hemostatic agent. The neural function problems in ABS usage after surgical and dental procedures are reported. This study aims to research degenerative effect and mechanism of ABS on peripheral neural cells in “The model of neuron culture from mouse dorsal root ganglion".

 

METHODS

Preparing Neuron Culture: After anesthetizing mice with ketamine/xylazine, they are sacrificed with cervical dissection. Dorsal root ganglias are removed under microscope in an aseptic condition. Cell differentiation is done with collagenase+ trypsin+mechanical trituration and purification is done with percoll density gradient. The cells obtained from these procedures are plated to 35 mm glass petri dishes. Neuron culture are incubated for 48 hours under the moist condition which has 5% CO2 circulation at 37 °C. Propidium iodure (10μg/ml) is added to culture to monitor dead cells and Calcein AM (1μM) is added to monitor the living cells.

 

Microscopic visualization: “Zeiss Cell Observer”, a microscopic visualization system allowing visualizing at desired mode and density with developed camera-computer and special software setup that can hold neurons under physiological conditions, is used. Mozaix mode is chosen for visualizing the living and the dead neuron cells.

 

Groups:

- First Group is added ABS(2.5%)

- Second Group is added Caspase-3 inhibitor(100 μM) first and ABS(2.5%) one hour later.

- Third Group is added Caspase-6 inhibitor(100 μM) first and ABS(2.5%) one hour later.

- Control Group is added physiological saline (PS).

 

RESULTS: In the beginning of the study, 243, 231, 175 and 249 living neurons are observed in first, second, third and fourth group, respectively. In the groups (I-II-III) added ABS, the neurons detected as living before application is observed dead completely after 12 hours. It is also observed that 5 cells become dead and 249 cells become alive in the control group which is applied PS.

For the purpose of determining whether there is a difference between groups in terms of rates of living neuron, the rate comparison is done with “Z test”. As meaningful statistical difference is not found between experimental groups in terms of rates of living neuron, the difference of control group from each three groups is found meaningful statistically(P < 0,01).

CONCLUSİON:

1. ABS causes degeneration of sensory neurons.

2. Caspase-3 and Caspase-6 enzymes don’t exist in the pathway of neurodegeneration

3. Neurodegenerative effect of ABS should be taken into account in the clinical usage.

 

Keywords: Dorsal root ganglion neuron, Ankaferd BloodStopper, Degeneration